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Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 11652 (2023) Citare questo articolo

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L’editing del genoma CRISPR è un potente strumento per chiarire le funzioni biologiche. Per modificare il genoma come previsto, è essenziale comprendere le varie modalità di ricombinazione che possono verificarsi. In questo studio, riportiamo inserimenti di vettori complessi che sono stati identificati durante la generazione di alleli condizionali mediante editing CRISPR utilizzando l'unione finale mediata dalla microomologia (MMEJ). Il vettore di targeting conteneva due sequenze loxP e microomologie fiancheggianti da 40 bp. Le regioni genomiche corrispondenti alle sequenze loxP sono state scisse con Cas9 nelle cellule staminali embrionali di topo. Lo screening PCR per la ricombinazione mirata ha rivelato un'alta frequenza di bande di dimensioni maggiori del previsto. Il sequenziamento dei nanopori di queste bande ha rivelato inserimenti di vettori complessi mediati non solo da MMEJ ma anche da unione di estremità non omologhe e ricombinazione omologa in almeno il 17% dei cloni. Una nuova banda è apparsa dopo il miglioramento delle condizioni della PCR, suggerendo la presenza di alleli modificati involontariamente che sfuggono allo screening PCR standard. Ciò ci ha spinto a caratterizzare la ricombinazione di ciascun allele dei cloni genomici modificati utilizzando polimorfismi eterozigoti a singolo nucleotide, portando alla conferma della presenza di alleli omozigoti. Il nostro studio indica che è necessario un attento controllo di qualità dei cloni modificati dal genoma per escludere l'inserimento di vettori complessi, non intenzionali, sul bersaglio.

Negli ultimi anni, la tecnologia di modificazione del genoma ha fatto grandi progressi con l’avvento del sistema CRISPR1. Tuttavia, è sempre possibile che si verifichi una ricombinazione involontaria nell’editing del genoma CRISPR. Pertanto, il controllo di qualità dei cloni genomici modificati è importante per garantire che la ricombinazione prevista nei cloni non sia accompagnata da una ricombinazione involontaria. La ricombinazione involontaria può verificarsi nel sito target della ricombinazione o in regioni genomiche distanti dal sito target. Quest'ultimo tipo di ricombinazione si verifica spesso in sequenze genomiche simili alla sequenza target a causa della ricottura parziale degli RNA guida (gRNA). Tale ricombinazione viene definita effetto “fuori bersaglio” e sono stati sviluppati vari metodi per rilevarla2,3. Per quanto riguarda la precedente ricombinazione “sul bersaglio” non intenzionale, sono state segnalate ampie delezioni nel sito bersaglio4,5,6,7. Tipicamente, i ricombinanti di interesse vengono selezionati mediante PCR. Pertanto, le grandi delezioni genomiche che accompagnano la perdita dei siti di legame dei primer della PCR possono passare inosservate. Recentemente sono stati segnalati altri tipi di ricombinazione sul bersaglio non intenzionale in cui vettori gRNA o DNA mitocondriale sono inseriti nel sito di scissione genomica bersaglio8. Sebbene in questi casi i siti di legame dei primer della PCR fossero preservati, l'inserimento della sequenza esogena involontaria è passato inosservato nello screening iniziale della PCR perché la dimensione dell'amplicone della PCR era superiore al limite di rilevamento. Tale ricombinazione sul bersaglio non intenzionale deve essere attentamente esaminata, soprattutto quando si prevede l'editing genomico biallelico, poiché la perdita dell'allele wild-type (wt) verificata dall'analisi PCR può essere causata non dall'editing genomico omozigote ma dalla combinazione di ricombinazioni previste ricombinazione in un allele e ricombinazione involontaria nell’altro allele.

Nel presente studio, riportiamo modelli di inserimento di vettori sul bersaglio non intenzionali, complessi, che abbiamo identificato nel processo di generazione di alleli condizionali per il sistema Cre/loxP in cellule in coltura. Per generare un allele condizionale è necessario inserire due sequenze loxP, una a monte e l'altra a valle della regione genomica target. Inoltre, per eseguire l'analisi fenotipica nelle cellule in coltura, entrambi gli alleli devono essere modificati nello stesso modo. Pertanto, è necessario inserire nel genoma un totale di quattro siti loxP. Diversi percorsi di riparazione, ovvero la ricombinazione omologa (HR), l'unione delle estremità non omologhe (NHEJ) e l'unione delle estremità mediata dalla microomologia (MMEJ), possono essere impiegati per introdurre sequenze estranee nel genoma. L'HR è il percorso più utilizzato e richiede un braccio di omologia di 500–1000 bp nel vettore di targeting9. Si ritiene che la via HR sia attiva principalmente dalla fase S tardiva alla fase G2 del ciclo cellulare10. Al contrario, la via NHEJ è attiva durante tutto il ciclo cellulare10. Pertanto, il metodo basato su NHEJ consente l'inserimento mirato in tipi cellulari in cui il metodo HR è inefficiente, come i neuroni, sebbene la sequenza di giunzione nel sito di ricombinazione sia difficile da controllare rispetto a quella in HR11. Più recentemente, è stato sviluppato un metodo chiamato sistema PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) che utilizza MMEJ12,13. Questo metodo utilizza bracci di microomologia lunghi fino a 10-40 basi per la ricombinazione. Si dice che il percorso MMEJ sia attivo principalmente dalla fase M alla fase S iniziale, consentendo una diversa modalità di ricombinazione rispetto all'HR. Abbiamo utilizzato il metodo PITCh nel presente studio perché l'inserimento della sequenza loxP di 34 basi nel genoma può essere facilmente rilevato mediante PCR a causa della breve lunghezza del braccio di omologia del vettore di targeting. Tuttavia, lo screening PCR ha rivelato bande di dimensioni non previste che erano più lunghe del previsto ad alta frequenza. L'analisi di queste bande con il sequenziamento a lettura lunga di Nanopore ha rivelato inserimenti di vettori complessi che coinvolgono non solo MMEJ ma anche HR e NHEJ. La dimensione della sequenza vettoriale inserita potrebbe essere oltre il limite di rilevamento del metodo standard di controllo qualità basato sulla PCR per i cloni genomici modificati. Proponiamo che la ricombinazione sul bersaglio involontaria rilevata in questo studio debba essere attentamente esclusa nella fase di controllo di qualità dell'editing del genoma.